近年来，由于抗生素的滥用和泛用，导致细菌耐药性的产生。耐药性细菌引发的感染频繁发生，临床医务工作者对此几乎束手无策，治疗陷入“无药可治”的尴尬局面。铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)是一种革兰氏阴性微生物，占全世界医院感染10-20%。通常用于治疗P. aeruginosa感染的抗生素剂包括β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类。此外，多粘菌素也可用于治疗多重耐药菌株，但是它们具有高的毒副作用。由于细菌生物被膜的低渗透性和对药物的外排作用，以及P. aeruginosa对常规抗生素剂具有的自身抗性，会导致多种并发症、治疗失败甚至死亡。因此，迫切需要发展一种针对P. aeruginosa的非抗生素策略用于治疗其感染。众所周知，细菌等微生物使用其凝集素与宿主组织上的糖基元能发生特异性作用，已有研究表明P. aeruginosa表面凝集素LecA和LecB能够介导其生物膜的形成。因此，这两种凝集素是预防细菌定植和潜在生物膜形成的靶标。事实上，凝集素与蛋白质相互作用的三维的多价异质对于生物膜的调控至关重要，但目前在设计细菌抑制剂时却很少考虑到。
      我院张新歌副教授与美国韦恩州立大学曹智强副教授合作开发了一种新型仿生非抗生素的纳米制剂。该纳米抗菌剂的设计是基于在50-100纳米尺度结构上两种类型糖模拟自然界的多价异质作用和特异性靶向P. aeruginosa上的LecA和LecB凝集素，这种新的阻断方法能够模拟碳水化合物-凝集素之间相互作用的自然强化机制，而显著的杀菌效果则来源于金纳米棒良好的光热转化能力。当其浓度为500 μg/mL时，在近红外激发后温度可高达80 oC，显示良好光热效应(图1)。

图1.仿生纳米抗菌剂的制备及其光热性质

研究人员采用FITC标记的伴刀豆球蛋白A将生物被膜胞外多糖染色，呈现绿色荧光，用溴化乙锭将P. aeruginosa染色，呈现红色荧光。如图2所示，未处理的对照组生物被膜中细菌密集排列并形成完整的片层。相比之下，AuNRs@pLAMA/pFEMA处理后则仅有少量细菌和胞外多糖残留。其中AuNRs@pLAMA/pFEMA-50展示最明显的生物被膜抑制效果。与AuNRs@pLAMA-50和AuNRs@pFEMA-50相比，AuNRs@pLAMA/pFEMA-50显示出显著的生物被膜形成抑制能力。

图2.仿生纳米抗菌剂抑制生物被膜的形成

研究人员采用肺泡基底上皮细胞A549与P. aeruginosa共培养以模拟细菌感染过程，评价仿生纳米抗菌剂抑制P. aeruginosa粘附宿主细胞的能力。加入的AuNRs@pLAMA/pFEMA竞争结合细菌，以阻止细菌与细胞的结合。如图3所示，PBS处理组中可观察到大量的细菌粘附在细胞膜表面，部分细胞甚至呈现出凋亡早期现象。根据细胞毒性结果，使用125 μg/mL的AuNRs@pLAMA，AuNRs@pFEMA和AuNRs@pLAMA/pFEMA-50处理感染后细胞，可观察到细胞上粘附的细菌数量显著减少。这一现象表明AuNRs@pLAMA/pFEMA-50可以破坏A549细胞表面糖蛋白和P. aeruginosa凝集素之间建立的相互作用。AuNRs@pLAMA/pFEMA-50的抗粘附作用显着优于PBS对照组(p < 0.01)，而且AuNRs@pLAMA-50和AuNRs@pFEMA-50与AuNRs@pLAMA/pFEMA-50也存在明显差异，证明两种糖聚合物之间存在着协同作用(图3)。研究发现含有一种类型配体的AuNRs@pLAMA-50和AuNRs@pFEMA-50仅去除约60％细胞上的P. aeruginosa (图3)。与单种配体修饰的金纳米棒相比，AuNRs@pLAMA/pFEMA-50表现出优异的细胞抗粘附能力，导致细胞表面上残留的细菌少于30％。以上结果表明，仿生纳米抗菌剂能够破坏上皮细胞糖蛋白和细菌凝集素之间建立的相互作用，可作为抗粘附剂用于细菌感染治疗。

图3. 仿生纳米抗菌剂抑制细菌对宿主细胞的粘附

研究人员进一步运用免疫荧光抗体技术分析AuNRs@pLAMA/pFEMA-50光热治疗清除肺部的耐药菌。通过对P. aeruginosa的特异性抗体标记肺泡腔组织中的细菌，用DAPI对肺泡细胞染色（蓝色荧光），用Cy3对P. aeruginosa染色（红色荧光）。PBS和AuNRs@pLAMA/pFEMA-50组的小鼠和健康组相比，其肺泡腔内附着了大量的P. aeruginosa，证实肺部存在严重的感染。AuNRs@pLAMA/pFEMA-50光照组小鼠的肺泡腔与健康对照组小鼠类似，几乎没有观察到细菌的存在(图4)。证明AuNRs@pLAMA/pFEMA-50的光热治疗可有效地清除肺部的耐药菌。
      肺部组织病理学H&E染色结果显示，PBS和AuNRs@pLAMA/pFEMA-50组小鼠的肺泡结构严重受损，有大量炎性细胞浸润（图4）。相比而言，AuNRs@pLAMA/pFEMA-50光照组小鼠的肺泡损伤程度最小，完整度明显高于其他组，无大量炎性细胞。当气管及肺部受到P. aeruginosa感染后，气道上皮细胞可活化核转录因子（NF-κB）表达量增加，诱导促炎细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的产生。细菌性肺炎可促进NF-κB p65的表达，研究人员采用免疫荧光和免疫组织化学分析法观察支气管肺泡细胞中NF-κB p65的表达，同样用DAPI标记肺泡细胞，用Alexa Fluor 488（绿色荧光）标记NF-κB p65。如图4所示，肺免疫组织化学和免疫荧光结果显示AuNRs@pLAMA/pFEMA-50光热治疗显著降低NF-κB p65的表达。

图4.仿生纳米抗菌剂给药前后肺部的耐药菌和组织病理切片

研究人员开发了一种新型非抗生素的纳米制剂，该制剂通过两种类型的糖聚合物修饰三维结构的金纳米棒。这种新型制剂分别通过凝集素阻断和金纳米棒的近红外光诱导的光热效应，实现对耐药性肺炎的显著疗效。总之，新型仿生设计与光热杀灭能力的有效结合，有望成为一种替代治疗策略以对抗威胁性极强的抗药性传染疾病。该成果以题为" A Biomimetic Non-Antibiotic Approach to Eradicate Drug-Resistant Infections "发表在Advanced Materials期刊上(DOI: 10.1002/adma.201806024)。
      近年来,张新歌和李朝兴课题组针对细菌耐药性这一难题，依据细菌结构特征和感染微环境生物学特性，发展一系列功能化材料，评价其体内外的抗菌活性，进一步揭示其作用机制，相关研究成果发表在Advanced Materials, Biomaterials, Chemistry of Materials, Chemical Communications, Nanoscale, Biomacromolecules, ACS Applied Materials & Interfaces等期刊上。