规律成簇的间隔短回文重复序列 (clusteredregularly interspaced short palindromic repeats sequences, CRISPR)及失活的相关蛋白9（CRISPR/dCas9）系统可以在不剪切宿主基因组序列的条件下精确控制内源基因表达，从而为癌症治疗提供了一种新的方法。尽管CRISPR/dCas9系统在医学上具有很大的应用潜力，但对于癌症治疗来说，目前存在的最大的挑战是如何将CRISPR/dCas9系统安全高效地递送至肿瘤组织。

图1：多级递送纳米粒子的制备与体内递送示意图

近期，我院刘阳研究员与天津医科大学康春生教授合作在AdvancedScience（DOI:10.1002/advs.201801423）上发表文章，提出了一种多级递送纳米颗粒（MDNP），可以实现CRISPR/dCas9系统的肿瘤靶向递送并且在体内恢复内源miRNA表达。MDNP被设计为核-壳结构，环境响应性聚合物构成的壳层赋予MDNP根据体内微环境呈现不同表面特性的能力，从而克服多个生理障碍将CRISPR/dCas9系统递送到肿瘤部位并被肿瘤细胞高效摄取（图1）。

图2：多级递送纳米粒子在体外和体内的递送效率

研究人员首先使用荧光标记的质粒DNA作为模型，在体外和体内评估MDNP的递送效率。与在中性条件下（pH=7.4）相比，当MDNP在酸性条件下（pH=6.5）递送时，我们可以观察到细胞对质粒DNA的摄取显着增强（图2a）。纳米粒子在小鼠体内的分布同样证实了这一结果，表明MDNP具有较高的肿瘤靶向能力（图2b）。与PEI25k相比， MDNP在肝脏处的富集较少，表明PEG化的表面可以有效避免免疫系统对纳米粒子的清除。此外，与不具有环境响应性壳层的纳米粒子相比，MDNP也表现出更快和更高的肿瘤靶向能力，表明MDNP表面PEG壳层的脱除确实增强了纳米粒子在肿瘤处的富集。

图3：多级递送纳米粒子在体外和体内上调miR-524的表达

接下来，研究人员选择miR-524作为靶基因，通过CRISPR/dCas9系统激活miR-524的表达进而抑制与癌细胞增殖相关蛋白的表达。实验结果证明在肿瘤微酸性条件下用MDNP/dCas9-miR-524处理的细胞中上调miR-524水平、抑制下游蛋白表达（图3a,b），并且最终抑制肿瘤细胞的增殖（图3c）。随后通过向患有肿瘤的小鼠尾静脉注射MDNP/dCas9-miR-524，发现小鼠肿瘤中的miR-524的表达升高（图3e）、肿瘤的生长明显受到抑制（图3d），且在其他器官未产生明显的副作用（图3f）。这些结果证实使用MDNP可以在体内实现基于CRISPR/dCas9系统的基因表达调节，有望成为基于CRIPSR/dCas9系统的癌症基因疗法的新策略。