来源：研之成理

▲第一作者：叶卓      

通讯作者：刘定斌    

通讯单位：南开大学     

论文DOI：10.1002/anie.202204518      

01 全文速览

南开大学刘定斌团队设计了一种叫做iSHERLOCK（in-sequence high-specificity dual-reporter unlocking,）的“分子神探”高特异检测策略，实现了动脉粥样硬化斑块的精准识别与鉴定，为心血管疾病的早期检测、组织活检和手术导航提供了一种全新的成像手段。该研究成果于近期发表在化学顶级期刊Angew. Chem. In. Ed.上。

02 背景介绍

心血管疾病是全球致死和致残的主要因素，约占每年所有死亡人数的三分之一。动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一种慢性炎症性疾病，由动脉内脂质斑块积聚引起，是触发心血管疾病的首要病因。动脉粥样硬化斑块的形成和演变可使动脉血管狭窄，从而阻碍血液流动，导致严重的心血管事件如心肌梗死、中风、甚至猝死。因此，动脉粥样硬化斑块的精准鉴定有助于临床医生做出及时有效的病情判断，对心血管疾病的早期干预具有重要意义。临床上对动脉粥样硬化斑块的诊断基于MRI、CT、OCT等影像学方法，这些方法通常灵敏度和空间分辨率不足，无法实现早期微小斑块检测，亦无法提供病变处的分子生物学信息。为了解决这一重大临床难题，本文提出了一种iSHERLOCK策略，用于精准诊断动脉粥样硬化斑块。

03 本文亮点

（1）经过理性设计，利用模块化方法合成出了具有三合一单分子结构的可激活荧光探针。

（2）该探针可分别通过荧光“off-on”和比率响应检测脂滴（lipid droplet, LD）和HClO，揭示了泡沫细胞中HClO主要分布在LD表面。

（3）利用LD和HClO的同时检测，能够从病理角度精确地区分病变动脉与肝脏。

（4）克服了以往动脉粥样硬化斑块单靶标分析的缺陷，能够从脂质积累与氧化应激两个方面精确描绘斑块分布和勾勒出斑块边界。

04 图文解析

▲图1. iSHERLOCK的设计与响应机理。

作者首先采用模块化策略设计了iSHERLOCK探针。BODIPY 493/503 是常用的LD-Tracker，能够染色动脉粥样硬化斑块。由于其高量子产率、窄峰宽和易于修饰，被选作荧光母核来制备iSHERLOCK探针（图 1a）。一方面，高度亲脂性的双（三氟甲基）苯基与 BODIPY核心缀合，以增强探针的LD靶向能力。另一方面，对甲硫基亚苯基部分连接在 BODIPY母核的另一侧，赋予探针以高灵敏度和特异性报告HClO的能力。当存在LD 的情况下，探针通过亲脂相互作用很好地分散到LD的中性脂质中，导致红色荧光开启，作为“第一个报告分子解锁”的信号通道（图 1b）。随后，当探针-LD复合物遇到HClO时，探针中的硫醚被氧化成亚砜，削弱了其给电子能力，从而减弱了ICT效应。荧光从红色变为黄色，比率定量HClO，作为“第二个报告分子解锁” 的检测通道。通过依次荧光检测LD和HClO，iSHERLOCK可以精确识别体内和组织中的动脉粥样硬化斑块。

▲图2. iSHERLOCK对LDM和HClO的体外检测能力探究。

由于LD是生物体内产生的内源性细胞器，无法直接在体外检测。非极性LD模拟物（LDM）常被用作LD替代品来研究LD探针的响应。在 iSHERLOCK探针 (10 µM) 的水溶液中加入不同浓度的LDM，观察到两个以 615和 670 nm为中心的荧光发射带（图 2a）。浓度依赖性荧光增强很可能是由于iSHERLOCK探针对LDM的高亲和力，导致探针分子在LDM表面有效分散。在低浓度下，LDM的检测限（LOD）确定为157 ng/mL（图2b）。这些结果表明iSHERLOCK探针可以通过“off-on” 机制定量检测脂质积累。

在验证了LD的光谱检测后，作者进一步考察了iSHERLOCK探针是否可以通过比率响应检测 HClO。将HClO添加到含有iSHERLOCK探针-LDM 复合物的水溶液中后，最大发射带从 615 转移到600 nm，同时在670 nm处的发射峰强度减少（图 2c）。通过绘制600和670 nm (F600/F670) 的荧光强度比与HClO浓度的关系，得到标准曲线 (图 2d)。HClO的检测限被确定为 87 nM。动力学曲线表明氧化可以在几分钟内完成（图 2e）。为了评估iSHERLOCK探针对HClO 的选择性，将可能的干扰物质，包括活性氧和氮物质（ROS/RNS，1.5 mM）与iSHERLOCK探针溶液一起孵育。如图 2f 所示，相较于HClO，其他ROS和RNS引起的荧光较弱。因此，iSHERLOCK探针 对 HClO 表现出很高的选择性，表明了其在复杂生物系统中识别 HClO 的能力。

▲图3.具有不同脂质积累和氧化应激水平的细胞荧光成像分析。

脂多糖 (LPS) 和肉豆蔻酸佛波醇 (PMA)是一类典型的刺激物，可触发活细胞中产生 HClO。作者利用LPS/PMA处理RAW264.7 细胞来研究 iSHERLOCK探针检测内源性HClO的能力。将LPS/PMA处理过的细胞与iSHERLOCK探针(1 μM) 一起孵育后，在黄红两种荧光通道中仅观察到非常微弱的荧光（图 3）。然而，在细胞质中检测到了Y/R比率信号的均一分布，表明形成了 HClO。作者进一步将iSHERLOCK引入了对 AS 相关泡沫细胞中的LD和HClO的监测。泡沫细胞是AS斑块的主要成分，由Ox-LDL处理后的巨噬细胞转化而来，其形成于AS早期，因此被认为是引发慢性炎症事件的关键驱动因素。随着Ox-LDL的添加，大量的LD出现在泡沫细胞内。同时，Y/R比率信号变亮，表明Ox-LDL引起了HClO的产生。同时，作者还发现在LD表面产生的HClO水平最高，其次是细胞质。ISHERLOCK是第一个能够绘制泡沫细胞中HClO分布的探针，表明其对氧化应激下LD的生物学和生理学研究的适用性。

作为另一个比较，油酸（oleic acid, OA）诱导的HepG2细胞由于富含脂质，在黄色和红色通道中均检测到较强的荧光，在Y/R比率通道并未检测到荧光，表明细胞中存在丰富的脂质积累而没有发生氧化应激。以上细胞水平的结果表明，iSHERLOCK可以有效区分泡沫细胞和其他细胞，这对于精确识别AS斑块至关重要。

▲图4.小鼠动脉粥样硬化斑块和主要器官的离体成像。

作者在动物水平探究了iSHERLOCK对动物粥样硬化斑块的精准检测能力，解剖了ApoE-/-AS病变小鼠并与C57BL/6J健康小鼠做对比，并采集了它们的主动脉和主要器官进行荧光成像研究（图 4a）。随着ApoE-/-小鼠AS病变的形成，在主动脉斑块区域和肝脏中观察到更强的荧光信号。通过收集相应的平均辐射效率（MRE，图 4b，c）来量化主动脉和肝脏的荧光强度。在氧化应激方面，ApoE-/-小鼠主动脉中的Y/R比率显著高于同一只小鼠肝脏中的Y/R比率（**** p < 0.0001，n=3）（图 4d）。此外，ApoE-/-小鼠主动脉的Y/R比率比健康小鼠高得多（** p < 0.01，n=3）。相比之下，两组之间肝脏中的Y/R比值没有显著差异。这些结果意味着主动脉斑块和肝脏都积累了丰富的脂质。然而，氧化应激仅发生在AS病变的主动脉弓。这些结果证实，那些仅能够检测脂质积累的探针（如LD Tracker）对于 AS 诊断缺乏足够的准确性。ISHERLOCK是第一个通过同时检测AS斑块中脂质积累和氧化应激水平来精确检测AS的策略。

▲图5.小鼠主动脉冰冻切片成像

为了确认主动脉中的AS斑块，作者使用市售的LD-Tracker作为对比剂对主动脉切片进行染色。ApoE-/-小鼠主动脉中iSHERLOCK探针（红色和黄色通道）和LD-Tracker（绿色通道）的信号比健康小鼠中的信号强得多（图 5），证实了AS斑块中丰富的脂质积累。令人振奋的是，作者通过 iSHERLOCK探针的Y/R 比率通道描绘了主动脉的形态，同时该通道可以清楚地勾勒出斑块和动脉壁之间的边缘。作者利用此通道来量化主动脉中的相对氧化应激水平，在 ApoE-/-小鼠的主动脉弓和胸主动脉的斑块中检测到最强烈的氧化应激。总的来说，iSHERLOCK 能够在脂质积累和氧化应激两方面提供斑块状态的分子信息，大大优于已报道的用于AS诊断的荧光探针，从而为AS的临床组织活检提供了新的影像学手段。

05 总结与展望

本文提出了基于iSHERLOCK“分子神探”的双靶标荧光探针，用于精确识别泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块。ISHERLOCK通过连续的“off-on”和比率信号对LD和HClO进行高灵敏和高特异性检测，实时监测了两个与动脉粥样硬化相关的生物分子事件（即脂质积累和氧化应激）。由于其易于合成和高生物相容性，我们相信 iSHERLOCK 可用于动脉粥样硬化斑块的临床鉴定，在揭示动脉粥样硬化的病理机制以及辅助精确组织活检方面具有巨大潜力。最后，基于iSHERLOCK的分子设计策略只需改变识别基团，便可以方便地扩展到其他靶标检测领域，具有良好的通用性。

06 作者介绍

通讯作者简介

刘定斌，国家海外人才计划入选者。2006年本科毕业于兰州大学，2012年博士毕业于国家纳米科学中心（师从蒋兴宇教授），随后在美国国立健康研究院（师从Shawn Chen教授）开展疾病诊断研究；2014年加入南开大学化学学院，任研究员/教授、药物化学生物学国家重点实验室体外检测与分子影像研究室课题组长（PI）。近年来，已在生物医学检测和临床诊断领域发表论文80余篇，其中第一或通讯作者论文50余篇，发表在Chem. Rev.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Nano、Nano Lett.、Theranostics、Anal. Chem.等享有盛誉的化学与生物医学杂志上。已获授权专利十余项，并实现了部分专利的成果转化。主持国家重点研发计划课题1项和国家自然科学基金面上项目4项（已结题2项）；荣获中华医学会青年科技奖；担任国际医学杂志Nanotheranostics副主编和《高等学校化学学报》青年编委。

第一作者简介

叶卓，南开大学2019级博士研究生，研究方向为活体分子事件的成像和分析。目前以第一作者发表SCI论文4篇，申请专利一项。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202204518