结直肠癌作为一种高发的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。其发病过程较为隐匿，早期阶段往往缺乏典型临床表现，通常多数患者确诊时已发展到中晚期，生存率仅为20%左右。若能在高危人群中进行早期筛查，通过腺瘤摘除手术将大大提高患者的生存率（~90%）。由于缺乏可靠的生物标志物，现有的结直肠癌筛查方法仍存在入侵性强、灵敏度低、成本高等问题，给大规模推广应用带来困难。因此，亟需发展简单、快速、有效的结直肠癌筛查方法。

细胞外囊泡（EVs）包含来自亲本细胞的分子信息，是液体活检中备受关注的癌症生物标志物。近日，南开大学化学学院刘定斌教授团队发现粪便来源的细胞外囊泡（fEVs）中的miRNA可以作为结直肠癌无创诊断和预后的生物标志物。相关成果以“Machine Learning-Aided Identification of Fecal Extracellular Vesicle microRNA Signatures for Noninvasive Detection of Colorectal Cancer”为题发表在ACS Nano上。该论文的第一作者为南开大学化学学院博士研究生张兆伟，通讯作者为南开大学化学学院刘定斌教授、天津市人民医院许晨教授、天津医科大学肿瘤医院刘洋副教授和中石化（北京）化工研究院有限公司医用卫生研究所李晓敏副研究员。该工作获得国家自然科学基金和中石化项目的资助。

在前期工作中，团队发现fEVs上的两种膜蛋白（CD147和A33）能够作为结直肠癌诊断和预后的标志物（JEV，DOI: 10.1002/jev2.12300）。粪便与肠道有着特殊关联性，因而fEVs更加集中地携带了结直肠肿瘤的生物信息。miRNA是一类重要的小分子非编码RNA，具有转录后调控基因表达的功能，与肿瘤的发生、发展密切相关。在这项工作中，团队报道了fEVs携带的miRNA能够作为结直肠癌标志物，在诊断和预后监测中发挥作用。

图1 研究示意图

首先，作者通过miRNA测序考察正常个体和结直肠癌患者的fEV-miRNA表达谱，初步得到了候选miRNA标志物。随后，利用RT-qPCR在更多样本中对测序结果进行验证，进一步确定了4条miRNA标志物。同时，为了更加便捷地对fEV-miRNA进行检测，作者建立了基于CRISPR/Cas13a的miRNA检测平台。最后，借助特征工程和线性判别分析（LDA），分别建立针对结直肠癌诊断、预后监测和早期预警的机器学习模型。（图1）

图2 fEV表征及miRNA测序

通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫蛋白印迹（Western Blot）对fEVs进行表征，结合miRNA测序结果，初步得到11条候选miRNA标志物。（图2）

图3 标志物的RT-qPCR验证

在10例正常个体和30例结直肠癌患者中，利用RT-qPCR对测序结果进行验证，进一步确定了4条miRNA标志物（P < 0.05，miR-16-2-3p，miR-375-3p，miR-378a-3p，miR-7-5p）。（图3）

图4 基于CRISPR/Cas13a的miRNA检测体系

为了更加简便地在大规模临床队列中进行miRNA检测，作者建立了基于CRISPR/Cas13a的miRNA检测体系。当crRNA识别到靶标miRNA后，会激活Cas13a的反式切割活性，从而切割报告探针，释放荧光信号。针对4条miRNA标志物设计crRNA，考察工作曲线、检测特异性并与金标准RT-qPCR进行对比，验证了检测方法的可靠性。（图4）

图5 结直肠癌诊断模型的建立（训练集）

作者考察了31例正常个体和26例结直肠癌患者的miRNA标志物表达水平，采用特征工程联合LDA算法，将4条miRNA转化为复合指标LDA Score，利用训练集建立模型，并在验证集中对模型进行了验证。结果表明，结直肠癌诊断模型具有良好的AUC值（训练集0.9864，验证集0.9405）、特异性（训练集93.5%，验证集92.8%）和敏感性（训练集100%，验证集91.7%），证实了fEV-miRNA在结直肠癌诊断中的效能。随后，将LDA Score与临床常用血液指标CEA和CA19-9进行比较，在38例结直肠癌患者中，LDA Score成功诊断出37例患者，诊断灵敏度达到97.4%，诊断效果明显优于CEA（10/38，26.3%）和CA19-9（3/38，7.9%）。（图5，图6）

图6 fEV-miRNA用于结直肠癌诊断（验证集）

接着，收集预后（接受手术）的结直肠癌患者的粪便样本，并考察了训练集和验证集中的LDA Score指标变化。为了进一步确认LDA Score在结直肠癌预后监测中的潜力，作者开展了纵向研究，收集10例术前-术后配对的粪便样本。LDA Score在术后样本中显著下调，证明LDA Score能够对结直肠癌预后进行有效的监测。（图7）

图7 fEV-miRNA用于结直肠癌预后评估

综上所述，该研究表明fEV-miRNA能够作为无创的结直肠癌标志物，在诊断和预后监测方面具有广阔的应用前景，有望为结直肠癌筛查带来新的思路。

参考文献：

Machine Learning-Aided Identification of Fecal Extracellular Vesicle microRNA Signatures for Noninvasive Detection of Colorectal Cancer. ACS Nano 2025. DOI: 10.1021/acsnano.4c16698.